Department of Immunology

University of Debrecen

  • A betűméret növelése
  • Alapértelmezett betűméret
  • A betűméret csökkentése

Bácsi Attila PhD

E-mail Nyomtatás PDF

Bácsi Attila PhD
Molekuláris biológus, egyetemi adjunktus

Kutatási témák:
A pollenszemek által kiváltott allergiás reakciók molekuláris mechanizmusa
A humán plazmacitoid dendritikus sejtek m?ködésének vizsgálata

 

 

 

 

 


 

1. A REAKTÍV OXIGÉNGYÖKÖK SZEREPE AZ ALLERGIÁS FOLYAMATOK KIALAKULÁSÁBAN
Résztvev?k: Csillag Anikó, Pázmándi Kitti, Magyarics Zoltán, Asztalos Zoltán, Debreczeni Zsuzsa
Kollaborációs partnerek: Boldogh István, University of Texas Medical Branch, Galveston, USA
Sipka Sándor, III. sz. Belgyógyászati Klinika
Szilasi Mária, Tüd?gyógyászati Klinika
Kemény-Beke Ádám, Szemklinika

A pollenszemek által okozott allergiás kórképek napjainkban már népbetegségnek számítanak. Az intenzíven folyó kutatások eredményeként ma már sokat tudunk arról, hogy az érzékenyített egyénekbe bejutó pollen eredet? allergének hogyan váltják ki a hízósejtek degranulációját és az allergiás tüneteket. Ismertek a hízósejtekb?l felszabaduló korai és kés?i mediátorok, és részletesen feltárták már azt is, hogy ezek a mediátorok milyen szerepet játszanak az azonnali allergiás tünetek, valamint az allergiás gyulladás kialakulásában. Számos alapkérdés azonban még mindig megválaszolásra vár. Nem ismert, hogy az egyébként ártalmatlannak t?n? pollen eredet? fehérjékkel, glikoproteinekkel szemben egyáltalán miért alakul ki immunválasz, hiszen az immunválasz kialakulását magyarázó „veszély” elmélet szerint csak azok a struktúrák váltanak ki adaptív immunválaszt, amelyek valamilyen kárt okoznak, illetve vész-szignálokat indukálnak a szervezetben. Az eddig megismert pollen eredet? allergének azonban az allergiás reakciók kiváltásán kívül semmilyen károsodást nem okoznak a szövetekben. Az adaptív immunválasz els?dleges aktiválásában meghatározó szerepe van a hivatásos antigén prezentáló sejteknek (APS), így a dendritikus sejteknek (DS) is. A DS-ek csak aktiválódás után képesek bevándorolni a környéki nyirokcsomókba, és ott a T-limfocitákkal kölcsönhatásba lépve elindítani az adaptív immunválaszt. A DS-ek aktiválódását különböz? eredet? vész-szignálok válthatják ki. Egy nemrég lezárult kísérletsorozatban kimutattuk, hogy a hidratálódott pollenszemek NAD(P)H oxidázaik révén reaktív oxigéngyökök képzésére képesek (1. ábra).  A pollenszemek által termelt reaktív gyökök perceken belül oxidatív stresszt okoznak az egerek légúti és konjunktivális hámsejtjeiben.  Hízósejt-, T-sejt-, illetve B-sejt-deficiens egereken végzett kísérletekkel igazoltuk, hogy ez a hatás független az adaptív immunválasztól. Az el?zetesen parlagf? (Ambrosia artemisiifolia) pollen kivonattal érzékenyített egerekben a parlagf? pollen expozíciót követ?en allergiás légúti gyulladás alakul ki. Ha gátoljuk a pollen eredet? reaktív oxigéngyökök termel?dését, drámai módon csökken az eozinofíl granulociták által közvetített gyulladás. Ez arra utal, hogy a pollen eredet? NAD(P)H oxidázoknak alapvet? szerepe lehet az allergiás reakciók kialakulásában. Eredményeink alapján a pollen eredet? allergiás gyulladások kialakulásához a pollen eredet? antigének és a pollen NAD(P)H oxidázok által a hámsejtekben kiváltott oxidatív stressz egyidej? jelenléte szükséges. Korábbi megfigyeléseinket meger?sítik azok az új eredmények, miszerint laktoferrin (vasköt? antioxidáns) jelenlétében a parlagf? pollen kivonat nem képes allergiás gyulladást kiváltani a szenzibilizált egerekben. Fontos hangsúlyozni, hogy eddigi kísérleteinket, amelyekben a pollen NAD(P)H oxidázok hatását vizsgáltuk az allergiás reakciók kialakulásában, el?zetesen szenzibilizált egereken végeztük. További kísérleteinkben azt tanulmányozzuk, hogy a hidratálódott pollenszemek által termelt reaktív oxigéngyököknek van-e szerepe az érzékenyítés folyamatában, azaz hozzájárulnak-e a DS-ek, és ez által az allergén-specifikus T-sejtek els?dleges aktiválásához és allergiás irányú polarizációjához.
Vizsgálatainkban arra is kíváncsiak vagyunk, hogy különböz? antioxidánsok milyen mértékben képesek semlegesíteni a pollen NADPH oxidázok által termelt reaktív oxigéngyököket. Eredményeink szerint az egerek tüdejében az aszkorbinsav + N-acetil-cisztein kezelést követ?en már 15 perccel jelent?sen megemelkedik a teljes antioxidáns kapacitás, de 2 óra alatt visszatér a kiindulási szintre. Ezen megfigyelés alapján olyan antioxidánsnak, vagy olyan beviteli módnak lehet terápiás jelent?sége a pollenek által indukált allergiás betegségekben, amely tartósabb védelmet biztosít a légúti hámsejtek számára. Ebb?l kiindulva vizsgáltuk, hogy ciklodextrin nanopartikulákba csomagolt tocopherol (CNT) képes e kivédeni a pollenkivonat kezelés hatására létrejöv? oxidatív stresszt a humán tüd?hám eredet? sejtekben. Kísérleti rendszerünkben a CNT hatásosabbnak bizonyult, mint a tocopherol vizes oldata. Vizsgálatainkban azt is kimutattuk, hogy a lokálisan alkalmazott CNT tartósabban emeli meg a légutak antioxidáns kapacitását az egerekben, mint a vízben oldott antioxidánsok.
A csecsem?kori immunrendszer m?ködésének szabályozásában dönt? szerepet játszik a leghatásosabb antigén prezentációt végz? sejttípusnak, a DS-eknek a fejl?dése. Míg a mieloid DS-ek mennyiségében a csecsem?k életének els? nyolc hónapjában nincs lényeges változás, addig a plazmacitoid dendritikus sejtek száma és az általuk termelt IFN-? mennyisége közel harmadára csökken. Az is ismeretes, hogy az IFN-? gátolja a Th2 típusú, allergiára hajlamosító állapot létrejöttét. Az anyatejben többféle citokin, többek között IFN-? is detektálható, de annak mennyiségét még nem hasonlították össze atópiás és nem atópiás anyák tejében. Vizsgálatainkban azt szeretnénk tisztázni, hogy van-e összefüggés az egészséges és az atópiás anyák anyatejében lev? IFN-? mennyisége, és a gyermekekben kialakuló atópiás hajlam között. Az allergiás légúti gyulladás egér modelljében azt is megvizsgáljuk, hogy az itatóvízbe hosszú id?n át (6 hét) adagolt IFN-? és laktoferrin képesek-e befolyásolni a parlagf? pollennel szembeni érzékenyítés folyamatát, valamint nazális pollen expozíciót követ?en megváltoztatják-e az allergiás gyulladás intenzitását.


1. ábra. Hidratálódott pollenszem reaktív oxigéngyök termelése (DCF fluoreszcencia).

2. A POLLENSZEMEK ÁLTAL TERMELT REAKTÍV OXIGÉNGYÖKÖK HATÁSA A MONOCITA EREDET? DENDRITIKUS SEJTEK M?KÖDÉSÉRE
Résztvev?k: Csillag Anikó, Pázmándi Kitti, Magyarics Zoltán, Gogolák Péter
Kollaborációs partnerek: Boldogh István és Sanjiv Sur, University of Texas Medical Branch, Galveston, USA

A légutak dendritikus sejtjei (DS) képesek kölcsönhatásba lépni a belélegzett pollenszemekkel (2. ábra). Munkánk során azt vizsgáltuk, hogy ez a közvetlen kapcsolat kivált-e oxidatív stresszt a DS-ekben és ez jár-e funkcionális változásokkal. Kísérleteinkben a humán monocita eredet? DS-eket parlagf? pollenszemekkel kezeltünk. Eredményeink szerint pollen expozíciót követ?en a DS-ekben megemelkedett a reaktív oxigéngyökök szintje. A pollenszemek által indukált oxidatív stressz az IL-8, valamint pro-inflammatórikus citokinek, TNF-? és IL-6 termelését váltotta ki. A pollen expozíció hatására a DS-ek érett állapotban kerültek, amit a CD80, CD86, CD83 és HLA-DR molekulák, és kisebb mértékben a CD40 megnövekedett sejtfelszíni kifejez?dése igazolt. A T-limfociták aktiválódásának vizsgálatához a pollen-kezelt DS-eket autológ naív T-sejtekkel tenyésztettük együtt. A pollenszemekkel kezelt DS-ek a naív T-sejtekb?l különböz? funkciójú effektor T-sejt populációk kialakulását indukálták. Antioxidáns alkalmazásával a DS-ek fenotípusos és funkcionális változásait is gátolni tudtuk, ami alátámasztja az oxidatív stressz jelent?ségét ezekben a folyamatokban. Eredményeink azt mutatják, hogy a pollenszemek által indukált oxidatív stressz hozzájárulhat a lokális természetes immunválasz kialakulásához, továbbá részt vesz a pollen antigének elleni adaptív immunválasz kiváltásában is.



2. ábra. A pollenszemek és a dendritikus sejtek kölcsönhatása a légutakban.

3. A HUMÁN PLAZMACITOID DENDRITIKUS SEJTEK VIZSGÁLATA ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁVAL
Résztvev?k: Magyarics Zoltán, Pázmándi Kitti

A plazmacitoid dendritikus sejtek (pDS-ek) professzionális antigén prezentáló sejtek (APS), melyeknek fontos szerepe van a vírusok elleni immunválaszban, illetve a szerzett és a természetes immunitás összehangolásában. A pDS-ek képesek naív T-sejtek aktiválására, és ez a hatás modulálható szintetikus TLR agonistákkal. Kísérleteink során megvizsgáltuk, hogy „A” (CpG2216) és „B” típusú (CpG2006) CpG oligonukleotidok hogyan módosítják a humán perifériás vérb?l izolált pDS-ek fenotípusos jellemz?it, valamint hogyan változtatják meg a sejtek által termelt citokinek mennyiségét. Eredményeink szerint az „A” típusú CpG oligonukleotidokkal történ? kezelés jelent?sen fokozta a CCR7 kemokin-receptor és a CD38 ekto-ATPáz kifejez?dését, valamint nagyfokú INF-?, IL-6 és TNF-? termelést eredményezett. A „B” típusú CpG oligonukleotidok fokozták a HLA-DQ (MHC-II) és a kostimulátor molekulák (ICOS-L, CD80) expresszióját, azaz hatékonyabbá teszik az antigén prezentációt, de csak kis mennyiség? citokin termelést váltanak ki. Megfigyeléseink alátámasztják a pDS-ek nagyfokú funkcionális flexibilitásáról alkotott korábbi képet.
A plazmacitoid dendritikus sejtek funkcionális sajátosságainak tanulmányozásához – az izolálási eljárások jelent?s id?- és költségigénye, valamint a pDS-ek nagyfokú ex vivo fragilitása miatt – olyan áramlási citometriás módszert dolgoztunk ki, aminek a segítségével a sejtek kis térfogatú (3-6 ml) perifériás vérben, szeparálás nélkül, egyetlen fluoreszcens festék alkalmazásával azonosíthatók. Az azonosításhoz a pDS-ek BDCA-4 pozitivitását és a sejtek fénytörési sajátosságait használjuk fel (3. ábra). A módszer el?nye, hogy 2 lézerrel m?köd?, 4 csatornás asztali citométerek esetén – ilyet használ a klinikai és a kutató laboratóriumok többsége – a pDS-ek azonosítása mellett 3 fluoreszcens csatorna szabadon marad további fenotípusos vagy funkcionális vizsgálatok számára. A perifériás vérben csak nagyon kis számban el?forduló humán pDS-ek széles kör? fenotípusos és funkcionális jellemzése segíthetik azoknak az új terápiás eljárásoknak a kifejlesztését, amelyek a pDS-ek m?ködésének in vivo modulálásán alapulnak.



3. ábra. Plazmacitoid dendritikus sejtek azonosítása perifériás vérben kett?s,
illetve egyszeres fluoreszcens jelöléssel.

4. AZ OXIDATÍV STRESSZ HATÁSA A HUMÁN PLAZMACITOID DENDRITIKUS SEJTEK FENOTÍPUSOS ÉS FUNKCIONÁLIS SAJÁTSÁGAIRA
Résztvev?k: Pázmándi Kitti, Magyarics Zoltán, Debreczeni Zsuzsa

A plazmacitoid dendritikus sejteket (pDS-eket) korábban kizárólag a csontvel?ben, a limfoid szervekben és a vérben azonosították. Legújabb kutatások szerint a gyulladt szövetekben is jelen vannak, ahol - számos tényez? mellett - a gyulladásos válasz során keletkez? reaktív oxigéngyökök is befolyásolhatják m?ködésüket. Munkánk során arra kerestük a választ, hogy a különböz? mérték? és idej? oxidatív stressz hogyan befolyásolja a TLR9 agonistával aktivált, illetve a nem aktivált pDS-ek életképességét, fenotípusos jellemz?it és citokin termelését.
Kísérleteinkben a pDS-eket egészséges véradók perifériás véréb?l izoláltuk. Az oxidatív stressz körülményeinek el?állítására a xantin-oxidáz/xantin (enzim/szubsztrát) rendszert, valamint hidrogén-peroxidot alkalmaztunk és négyszín? áramlási citometriával detektáltuk a sejtek életképességében és fenotípusos tulajdonságaiban bekövetkez? változásokat. Megfigyeléseink szerint a pDS-ek – a limfoid eredet? sejtekhez hasonlóan – érzékenyen reagálnak az oxidatív stresszre, ami a sejtek életképességének csökkenésében, valamint az általunk vizsgált sejtfelszíni molekulák (BDCA-2, HLA-DQ, BDCA-4) kifejez?désének és a sejtek citokin (INF-?, IL-6, TNF-?) termelésének csökkenésében is megnyilvánult. Megállapítottuk, hogy az oxidatív stressz felfüggeszti a TLR9 agonista pDS-ekre gyakorolt aktiváló hatását.

Eredményeink arra utalnak, hogy a gyulladásos sejtek által termelt oxigéngyökökkel reagáló pDS-ek – a naív T-sejtekkel való kölcsönhatás során – az adaptív immunválasz elindítása helyett a tolerancia kialakulásának kedvezhetnek(4. ábra). Ez a mechanizmus új lehet?séget teremthet a pDS-alapú immunterápiának, amennyiben az in vitro körülmények között reaktív oxigéngyökökkel kezelt pDS-ek in vivo körülmények között gátló hatást fejthetnek ki autoimmun betegségekben, vagy allergiás gyulladások során, amikor egy adott antigén elleni immunológiai tolerancia létrehozása a cél.

4. ábra. Az oxidatív stressz hatása a pDS-ek m?ködésére.